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恐懼和焦慮是不同的適應(yīng)性反應(yīng)，對(duì)生存至關(guān)重要?？謶质怯呻x散且確定的威脅刺激引發(fā)的，而焦慮則源于對(duì)潛在威脅的預(yù)期。杏仁核中央核（CeA）對(duì)于離散條件化恐懼反應(yīng)的獲得和表達(dá)至關(guān)重要，其在僵硬行為中的特定神經(jīng)元亞群的作用也已得到充分證實(shí)。以往的研究強(qiáng)調(diào)了終紋床核（BNST）在應(yīng)對(duì)不可預(yù)測(cè)或持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的威脅時(shí)的防御反應(yīng)中的作用。然而，與不可預(yù)測(cè)威脅處理和病理性焦慮相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路仍然知之甚少。

在此，作者通過使用改良的可預(yù)測(cè)CS（CS?）或不可預(yù)測(cè)CS（CS?）動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)島葉皮層對(duì)vBNST的興奮性輸入和杏仁核側(cè)核（CeL）對(duì)vBNST的抑制性輸入?yún)f(xié)同作用，觸發(fā)vBNST中GABA能神經(jīng)元對(duì)不可預(yù)測(cè)而非可預(yù)測(cè)威脅信號(hào)的選擇性激活。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，vBNST中的GABA能神經(jīng)元通過投射到杏仁核中央核（CeM）和腹側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（vlPAG）分別調(diào)節(jié)焦慮樣行為和僵硬行為。

1.vBNST中特定的GABA能神經(jīng)元群體調(diào)節(jié)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅的反應(yīng)

為了確定vBNST在應(yīng)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅時(shí)的神經(jīng)元?jiǎng)討B(tài)，小鼠接受了改良的恐懼條件反射（FC）任務(wù)訓(xùn)練。CS+和CS-信號(hào)均能引發(fā)小鼠的凍結(jié)行為（圖1A和1B）。晚期FC試驗(yàn)中對(duì)CS-的神經(jīng)反應(yīng)顯著強(qiáng)于適應(yīng)期和早期FC試驗(yàn)（圖1B-1E）。在CS測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，vBNST神經(jīng)元的Ca2+信號(hào)在CS-測(cè)試期間選擇性增加，而在CS+測(cè)試期間沒有變化（圖1F和1G）。vBNST中Vgat神經(jīng)元的Ca2+信號(hào)在CS-測(cè)試期間顯著升高（圖1H-1L）。作者的結(jié)果表明vBNST中的GABA能神經(jīng)元在應(yīng)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅信號(hào)時(shí)被選擇性激活。并且研究了vBNST GABA能神經(jīng)元在應(yīng)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅時(shí)的防御行為中的作用。在CS測(cè)試期間人工抑制vBNST中的GABA能神經(jīng)元，對(duì)CS-的凍結(jié)行為減少，而對(duì)CS+的凍結(jié)行為正常（圖2D和2E）。在沒有CS回憶的新環(huán)境中人工激活了vBNST中的CS-反應(yīng)性神經(jīng)元群體，發(fā)現(xiàn)ChR2-mCherry組的凍結(jié)行為增加（圖2M）。這些發(fā)現(xiàn)表明vBNST中不同的GABA能神經(jīng)元分別調(diào)控凍結(jié)和攝食行為。

圖1. 皮層-腦干緩慢呼吸環(huán)路的鑒別

圖2. vBNST中的GABA能神經(jīng)元調(diào)節(jié)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅的反應(yīng)

2. 激活I(lǐng)C-vBNST回路對(duì)應(yīng)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅至關(guān)重要

IC（島葉皮層）、CeL（中央杏仁核外側(cè)部）和CeM（中央杏仁核內(nèi)側(cè)部）顯示出更多向vBNST CS-反應(yīng)性細(xì)胞的投射，而vBNST攝食反應(yīng)性細(xì)胞則接收更多來(lái)自vCA1（腹側(cè)海馬CA1區(qū)）、ZI（未定帶）、PAG（導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)）和NTS（孤束核）的投射。IC引起了作者的興趣，因?yàn)樗诳謶钟洃浕貞浧陂g被激活，并且在焦慮障礙中報(bào)告了功能改變。作者發(fā)現(xiàn)，投射到vBNST的IC神經(jīng)元在CS+和CS-測(cè)試期間均表現(xiàn)出激活增加（圖3C和3D）。通過全細(xì)胞記錄驗(yàn)證了從IC到vBNST的單突觸興奮性連接的存在。電流鉗記錄顯示，藍(lán)光脈沖在感染AAV-ChR2(H134R)-EYFP的IC神經(jīng)元中誘導(dǎo)了時(shí)間鎖定的動(dòng)作電位發(fā)放（圖3E和3F）。短暫的光刺激vBNST中含有ChR2的IC末端，當(dāng)膜電壓保持在-70 mV時(shí)，在GABA能神經(jīng)元中誘發(fā)了興奮性突觸后電流（eEPSCs）。這些eEPSCs被浴液中的河豚毒素（TTX）消除，并可以通過應(yīng)用鉀通道阻滯劑4-氨基吡啶（4-AP）恢復(fù)。此外，eEPSCs可以被AMPAR拮抗劑NBQX消除（圖3G和3H）。

光遺傳學(xué)抑制IC-vBNST回路可以減少對(duì)CS-測(cè)試的凍結(jié)水平，但對(duì)CS+測(cè)試沒有影響（圖3I-3K）。因此，作者的結(jié)果證實(shí)，IC中的谷氨酸能神經(jīng)元與vBNST中的GABA能神經(jīng)元建立了單突觸連接，并且這些投射到vBNST的IC神經(jīng)元在應(yīng)對(duì)可預(yù)測(cè)或不可預(yù)測(cè)威脅信號(hào)時(shí)表現(xiàn)出高活性。

圖3. IC的興奮性投射到vBNST調(diào)節(jié)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅信號(hào)的反應(yīng)

3. CeL SOM?神經(jīng)元的前饋抑制控制vBNST對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅的反應(yīng)

在CS?測(cè)試期間，vBNST可能通過其他傳入神經(jīng)元的前饋抑制進(jìn)行調(diào)控。逆行示蹤結(jié)果顯示，CeL向vBNST中對(duì)CS?反應(yīng)的細(xì)胞群發(fā)送投射。因此，作者推測(cè)在CS?測(cè)試期間，CeL可能對(duì)vBNST施加前饋抑制。作者針對(duì)投射到vBNST的CeL神經(jīng)元，通過體內(nèi)纖維光度法記錄其Ca²?信號(hào)（圖4A和4B）。投射到vBNST的CeL神經(jīng)元的Ca²?信號(hào)僅在CS?測(cè)試中升高（圖4C和4D）。

生長(zhǎng)抑素（SOM）和蛋白激酶Cδ（PKCd）神經(jīng)元是CeL中兩種重要的GABA能抑制性神經(jīng)元，它們大部分不重疊，代表功能不同的神經(jīng)元。接下來(lái)，作者發(fā)現(xiàn)抑制CeLSOM-vBNST投射對(duì)CS?或CS?測(cè)試均無(wú)影響（圖4G-4I）。人工激活CeLSOM-vBNST投射在未經(jīng)過訓(xùn)練的小鼠中無(wú)法誘發(fā)僵硬行為，并且降低了對(duì)CS?的僵硬水平，但對(duì)CS?測(cè)試沒有影響（圖4J-4M）。激活CeLSOM-vlPAG投射可以在未經(jīng)過訓(xùn)練的小鼠中誘發(fā)僵硬行為。抑制CeLSOM-vlPAG投射會(huì)損害CS?測(cè)試中的僵硬行為（圖S5）。因此，CeL中特定的SOM?神經(jīng)元亞群在CS?測(cè)試期間對(duì)vBNST施加前饋抑制。

圖4. BNST投射的細(xì)胞神經(jīng)元通過抑制性突觸傳遞控制vBNST對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅的反應(yīng)

4. vBNST-vlPAG和vBNST-CeM環(huán)路分別調(diào)控僵硬行為和焦慮樣行為

vBNST中對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅反應(yīng)的神經(jīng)元群激活會(huì)導(dǎo)致焦慮樣行為，然而這些神經(jīng)元群的下游效應(yīng)尚不清楚。為了探究這一問題，作者進(jìn)行了活動(dòng)依賴性神經(jīng)元順行示蹤實(shí)驗(yàn)，追蹤vBNST中對(duì)條件刺激（CS?）反應(yīng)的細(xì)胞和進(jìn)食反應(yīng)的細(xì)胞的輸出。發(fā)現(xiàn)vBNST中CS?反應(yīng)性細(xì)胞更傾向于向CeM、vlPAG和VTA發(fā)送投射，而vBNST中進(jìn)食反應(yīng)性細(xì)胞更傾向于向PVN、LH和NTS發(fā)送投射。作者通過光遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，人工激活vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的下游靶點(diǎn)（vlPAG）可以誘導(dǎo)小鼠在新環(huán)境中或在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（OFT）中增加僵硬行為，而激活CeM則沒有這種效果。相反，激活從vBNST中CS?反應(yīng)性細(xì)胞到CeM的投射可以誘導(dǎo)焦慮樣行為。激活vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群到CeM的信號(hào)通路對(duì)OFT中的總行進(jìn)距離沒有影響，這表明從vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群到CeM的環(huán)路可能有助于焦慮樣行為，但與運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)。因此，vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群通過不同的輸出在應(yīng)對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅信號(hào)時(shí)發(fā)揮不同行為的作用。具體來(lái)說(shuō)，vBNST-vlPAG環(huán)路有助于僵硬行為，而vBNST-CeM環(huán)路有助于焦慮樣行為。

圖5. vBNST中對(duì)CS?反應(yīng)的神經(jīng)元分別投射到腹側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)和中央杏仁核，分別調(diào)節(jié)僵硬行為和焦慮樣行為

5. 針對(duì)vBNST環(huán)路的調(diào)控為焦慮癥治療提供了潛在方向

vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群在不可預(yù)測(cè)威脅誘導(dǎo)的焦慮中的生理作用尚不清楚。為了研究這一問題，作者在慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激（CUS）處理后記錄了CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的活動(dòng)。CUS組小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（OFT）和高架十字迷宮（EPM）測(cè)試中表現(xiàn)出更高的焦慮樣行為（圖S7E和S7F）。為了進(jìn)一步研究vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群在焦慮樣行為中的作用，作者進(jìn)行了光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，抑制vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群可以緩解CUS處理小鼠的焦慮樣行為（圖S7G-S7I）。

此外，作者發(fā)現(xiàn)抑制vBNST-CeM環(huán)路可以改善在OFT和EPM測(cè)試中觀察到的高焦慮樣行為（圖S7J-S7L）。因此，vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的過度激活通過投射到CeM促進(jìn)了CUS誘導(dǎo)的焦慮，而靶向vBNST中CS?誘導(dǎo)的神經(jīng)元群可能是緩解焦慮行為的潛在策略。

6. KCNQ3是通過穩(wěn)定vBNST活動(dòng)來(lái)治療不可預(yù)測(cè)應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮的潛在靶點(diǎn)

vBNST對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅反應(yīng)的神經(jīng)元群活動(dòng)發(fā)生改變的分子機(jī)制尚不清楚。因此，作者采用磷酸化翻譯核糖體親和純化（pTRAP）技術(shù)結(jié)合RNA測(cè)序，以鑒定vBNST對(duì)不可預(yù)測(cè)威脅反應(yīng)的關(guān)鍵分子。作者通過qPCR驗(yàn)證了vBNST神經(jīng)元中鉀通道表達(dá)的下調(diào)，其中KCNQ3 mRNA的表達(dá)下調(diào)最為顯著（圖6D）。免疫熒光染色證實(shí)，與CS?測(cè)試相比，vBNST中GABA能神經(jīng)元的KCNQ3表達(dá)在CS?測(cè)試中更低（圖6E和6F）。

隨后，通過Western blot實(shí)驗(yàn)研究了慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激（CUS）處理與KCNQ3表達(dá)之間的關(guān)系。CUS處理后KCNQ3蛋白和mRNA水平的下降（圖6G-6I）。vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性增加，且在腦片膜片鉗記錄中M型電流降低（圖7A-7E）。在CUS處理后，小鼠在家庭籠中vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元的活動(dòng)增加被抑制，導(dǎo)致在vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元中過表達(dá)KCNQ3后焦慮樣行為的相應(yīng)減少（圖7F-7K）。將KCNQ家族通道的激動(dòng)劑瑞替加濱注入vBNST可以減輕CUS處理后觀察到的電生理和行為改變，以及不可預(yù)測(cè)應(yīng)激后vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的過度活躍和焦慮行為（圖S12）。

圖6. 在CS?測(cè)試和CUS處理后，KCNQ3水平的降低被識(shí)別出來(lái)

結(jié)論

作者的研究闡明了調(diào)控不可預(yù)測(cè)威脅誘導(dǎo)焦慮的協(xié)同興奮性和抑制性神經(jīng)環(huán)路。vBNST中特定的GABA能神經(jīng)元作為不可預(yù)測(cè)威脅信息匯聚和焦慮誘導(dǎo)的中心，而KCNQ通道在神經(jīng)元興奮性中發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)于理解不可預(yù)測(cè)威脅誘導(dǎo)焦慮的神經(jīng)環(huán)路以及識(shí)別不可預(yù)測(cè)應(yīng)激后焦慮癥治療的潛在分子靶點(diǎn)具有重要意義。

SA218型場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（FCS）用于小型嚙齒類動(dòng)物（大、小鼠）環(huán)境相關(guān)條件性恐懼實(shí)驗(yàn)研究。嚙齒類動(dòng)物在恐懼時(shí)會(huì)表現(xiàn)出特有的不動(dòng)狀態(tài)（immobility），動(dòng)物在這種情況下傾向于保持靜止不動(dòng)的防御姿勢(shì)。抗抑郁藥和抗中樞興奮藥可以明顯縮短不動(dòng)狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)對(duì)象被給與一個(gè)聲音信號(hào)（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓(xùn)練稱為條件性訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行聲音信號(hào)或環(huán)境聯(lián)系性實(shí)驗(yàn)。一般情況下嚙齒類動(dòng)物對(duì)相應(yīng)的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號(hào)都會(huì)做出明顯的條件性恐懼反應(yīng)，如靜止不動(dòng)。這種測(cè)試可以在訓(xùn)練結(jié)束后立刻或幾天后進(jìn)行可以提供在條件信號(hào)影響下短期和長(zhǎng)期記憶的信息。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱

SA215型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（open field test）是觀察研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)精神變化、進(jìn)入開闊環(huán)境后的各種行為，例如動(dòng)物對(duì)新開闊環(huán)境的恐懼而主要在周邊區(qū)域活動(dòng)，在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)較少，但動(dòng)物的探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的動(dòng)機(jī)，也可觀察由此而產(chǎn)生的焦慮心理。

高架十字迷宮

SA211型高架十字迷宮是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來(lái)考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。目前被廣泛應(yīng)用于新藥開發(fā)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、動(dòng)物心理學(xué)等多個(gè)學(xué)科的科學(xué)-研究和計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)等領(lǐng)域。